Während des normalen Spielverlaufs werden auf dem Bildschirm kurzfristig Fehlermeldungen überblendet, die auf die äußere Rahmenhandlung anspielen.
Assassin’s Creed verfügt über eine Rahmenhandlung, die in einer näheren Zukunft angesiedelt wird. In dieser entführen Angestellte von Abstergo Industries, einer modernen Templer-Organisation, den Barkeeper Desmond Miles und unterwerfen ihn einem Verfahren, in dem er mittels des so genannten Animus das Szenario eines Vorfahren durchleben muss. Davon erhofft sich Abstergo, die restlichen Teile des Edensplitter, einem Artefakt, das zur Massenhypnose verwendet werden kann, zu finden.
Dieses Szenario setzt zeitlich im Jahre 1191 nach Christus an, als der Dritte Kreuzzug das Heilige Land zerriss. Im Geheimen verborgen und aufgrund ihrer Schonungslosigkeit gefürchtet, beabsichtigten die Assassinen, die Anfeindungen zwischen den verschiedenen Gruppen durch Unterdrückung aufzuhalten.
Zu Beginn des Spieles hat Richard Löwenherz gerade die Hafenstadt Akkon von den Sarazenen zurückerobert. Mit Hilfe dieser Ausgangsbasis bereiten sich die Kreuzfahrer darauf vor, nach Süden zu marschieren. Ihr Hauptziel ist Jerusalem, das sie im Namen der Kirche zurückerobern wollen. Allerdings beherrscht derzeit Saladin, Anführer der Sarazenenarmee, die Stadt. Gedemütigt durch Richards Sieg bei Akkon wird er diesem nicht erlauben, ihn erneut zu erniedrigen. Die Sarazenen formieren sich bei den Ruinen der Festung Arsur mit der Absicht, den Überfall der Kreuzfahrer abzuwehren und sie daran zu hindern, nach Jerusalem zu gelangen.
Wegen dieser Maßnahme ist der Rest des Heiligen Landes weitgehend ungeschützt. Während sich Richard und Saladin bekämpfen, erkennen die sich nun unbeobachtet fühlenden Statthalter in den verlassenen Provinzen die Chance, ihre Machtpositionen zu festigen. Ausbeutung, Manipulation und Provokation prägen das Bild.
Der Spieler übernimmt die Rolle von Altaïr, einem Assassinen, der nach dem Scheitern der Liquidierung des Templerführers Robert de Sable und der Wiederbeschaffung des Templerschatzes, in Ungnade fiel und zum Novizen degradiert wurde. Al Mualim, der Anführer der Assassinen, bietet ihm die Möglichkeit an, sich von seiner Schande zu befreien und seinen Rang wiederzuerlangen. Dafür muss Altaïr neun Personen ermorden, die für die erbitterten und sich ausweitenden Kampfhandlungen infolge des Kreuzzuges verantwortlich zu sein scheinen, um so ein Zeitalter des Friedens einzuläuten. Dabei lässt sich jede dieser Missionen in die Abschnitte Erkundung, Attentat und Flucht gliedern. Die potentiellen Opfer sind historische Personen aus der Zeit der Kreuzzüge. Je weiter sich der Spieler in der Geschichte fortbewegt, desto mehr gelangt er hinter die dunklen Machenschaften einer geheimen Verschwörung. Es ist ihm hierbei möglich, durch drei historische Städte der damaligen Zeit zu reisen: Jerusalem, Damaskus und Akkon. Auch Masyaf, die Bergfestung der Assassinen, die Kreuzfahrerstadt Arsur und das restliche Königreich stellen Spielorte der Handlung dar, die sowohl zu Fuß als auch zu Pferd zu erkunden sind.
Auf seinem Weg entdeckt Altaïr allerdings, dass seine Zielpersonen von mehr als nur der puren Lust an persönlichem Vorteil getrieben sind. Sie sind allesamt Mitglieder des Templerordens − einer Gruppe allzu ähnlich den Assassinen. Sie suchen nicht, wie anfangs geglaubt, nur nach Profit, sondern streben nach einer neuen Weltordnung. Nachdem Altaïr alle neun Templer umgebracht hat, stellt sich heraus, dass auch Al Mualim ein Templer ist und nun der alleinige Besitzer des Edensplitters ist. Obwohl Al Mualim mit dessen Hilfe Altaïr manipulieren kann, gelingt es diesem, seinen Meister zu töten und den Edensplitter an sich zu nehmen. Dieser zeigt auf einer Art Hologramm die Fundorte der restlichen Edensplitter.
Als Desmond wieder in die Gegenwart zurückkehrt, will ihn der Professor von Abstergo beseitigen, aber die Mitarbeiterin Lucy Stillman verhindert dies, indem sie den eventuellen zukünftigen Nutzen von Desmond bei der Bergung der Artefakte hervorhebt. Nun ist Desmond vollständig mit Altaïr synchronisiert und er kann auch dessen Adlerauge-Fähigkeit anwenden. Dadurch sieht er im Gebäude von Abstergo diverse Zeichen und Sätze. Außerdem sieht er dadurch, dass Lucy Stillmann seine Verbündete ist, was darauf schließen lässt, dass auch sie wie er ein Assassine ist.
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